Биофизики изучили структуру подложки из полимерных нановолокон и механизм её взаимодействия с сердечными клетками крыс. Эти исследования проводятся для создания регенеративной ткани сердца.
Ученые выяснили, что мышечные клетки — кардиомиоциты — при росте обволакивают нановолокна, а клетки соединительной ткани — фибробласты — опираются на нановолокна с одной стороны.
Статья с результатами опубликована в журнале Acta Biomaterialia. Работа была проведена в лаборатории биофизики возбудимых систем МФТИ в сотрудничестве с коллегами из ФГБУ "Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов им. В. И. Шумакова" и Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН в городе Пущино.
Руководитель лаборатории биофизики возбудимых систем МФТИ профессор Константин Агладзе рассказывает: "При помощи трёх независимых методов мы показали, что кардиомиоциты, развиваясь на подложке из нановолокон, покрывают их со всех сторон и в большинстве случаев приобретают форму "футляра". Фибробласты же имеют более жёсткую структуру и меньшую площадь взаимодействия с нановолокнами, поскольку опираются на них лишь с одной стороны".
Задачей регенеративной медицины является восстановление повреждённых или утраченных органов человеческого организма. Тканевая инженерия часто является единственным способом, позволяющим восстановить функции такого важного органа, как сердце, и добиться реабилитации человека. Учёным при создания ткани для "заплаток" органов необходимо исследовать не только свойства самих клеток ткани, но и их взаимодействие с подложкой, окружающим питательным раствором и соседними клетками.
Правильная опора — залог успеха
Основополагающую роль при росте, развитии и формировании регенерирующей ткани играет подложка, на которой выращиваются клетки. Исследователи выращивают клетки сердечных тканей на матрице из полимерных нановолокон. Последние могут иметь различную эластичность, электропроводимость и дополнительные "умные" функции, позволяющие в определённый момент развития клеток выпускать молекулы активных веществ. Нановолокна призваны имитировать внеклеточный матрикс — внешнюю поверхность клеток, осуществляющую структурную поддержку. Кроме этого, через них можно вводить вещества для биохимического воздействия на окружающие клетки. Поэтому для правильного выбора свойств нановолокон, приближающих искусственную систему к структурам in vivo (то есть "внутри живого организма"), необходимо изучить механизм их взаимодействия на наноуровне.
Что под микроскопом?
Для определения структуры и механизма взаимодействия сердечных клеток и нановолокон последовательно проводились три этапа исследований.
Сначала учёные рассмотрели строение кардиомиоцитов и фибробластов, выращенных на подложке из нановолокон с помощью конфокальной лазерно-сканирующей микроскопии. Этот метод основан на точечной подсветке мельчайших сегментов клетки, дающих изображения микрометровых частей, и постепенном "сканировании" по всему её периметру. Структуры кардиомиоцитов и фибробластов (ядро, компоненты цитоскелета эукариотических клеток) и нановолокна были предварительно помечены флюоресцентными антителами. Учёные получили 3D-изображения клеток и увидели, что оба типа клеток вытянуты вдоль нановолокон и имеют веретенообразную форму (рис. 1). Однако полученные данные не позволили рассмотреть непосредственно поверхность взаимодействия нановолокон с клетками.
Рисунок 1. Изображения, полученные с помощью конфокальной лазерно-сканирующей микроскопии сердечных клеток при рассмотрении 1) кардиомиоцита, 2) фибробласта. Предоставлено авторами исследования
Далее исследователи произвели ультратонкие срезы перпендикулярно направлению нановолокон и сделали «фотографии» методом просвечивающей электронной микроскопии. В ходе исследования, через нарезанные образцы пропускался пучок электронов, а приёмник, находящийся за объектом, фиксировал достигшие его электроны. Количество долетевших до приёмника электронов зависит от свойств и толщины материала. Различные клеточные структуры неодинаково поглощают проходящий пучок электронов. Биофизики увидели, что кардиомиоциты охватывают нановолокна со всех сторон, оставляя их посередине клетки. Однако при этом нановолокна всё же полностью отделены от клеточной цитоплазмы мембраной (рис. 2).
Рисунок 2. Изображение кардиомиоцита, обволакивающего нановолокно подложки в разрезе. Изображение получено методом просвечивающей электронной микроскопии. 1 — кардиомиоцит, 2 — нановолокно в разрезе. Предоставлено авторами исследования
Фибробласты не обволакивают нановолокна, а лишь опираются на них с одной стороны. Также на микрофотографиях электронной микроскопии видно, что ядра фибробластов менее эластичны по сравнению с другими клеточными структурами, что уменьшает пластичность клеток и способность к растяжению вдоль нановолокон (рис. 3).
Рисунок 3. Изображение фибробласта в разрезе, полученное методом просвечивающей электронной микроскопии. 1 — клетка фибробласта, 2 — нановолокно, er — эндоплазматический ретикулум, N — ядро. Предоставлено авторами исследования.
Просвечивающая электронная микроскопия позволила увидеть, что происходит на срезе. С помощью зондовой томографии учёные создали полноценную 3D-модель. Клетки, выросшие на подложке из нановолокон, были нарезаны на пластины толщиной 120 нм. Структуру их поверхностей изучили с помощью кремниевого зонда, а затем виртуально воссоздали (рис. 4).
Рисунок 4. 3D-модель кардиомиоцита, обволакивающего нановолокна, полученная методом зондовой томографии наносрезов клетки. Предоставлено авторами исследования.
Повышенное сцепление кардиомиоцитовВо-первых, повышенная механическая адгезия — сцепление подложки из нановолокон и кардиомиоцитов — способствует стабильности клеток на подложке. Значит, сердечная ткань (кардиомиоциты) при росте будут прочнее держаться на подложке. Ткань из фибробластов будет менее стабильно держаться на подложке.
Второе, что следует из результатов исследования: использование дополнительных функций подложки, таких как испускание регуляторных молекул (белков, активирующих процесс роста клеток) тоже будет отличаться у кардиомиоцитов и фибробластов. В случае кардиомиоцитов, обволакивающих нановолокна, испускаемое вещество будет полностью и без потерь диффундировать через клеточную мембрану в цитоплазму. А для фибробластов необходимо учитывать потери за счёт диффундирования в среду, окружающую клетки при росте.
И третье: кардиомиоциты полностью обволакивают нановолокна и изолируют их от жидкости, в которой они развиваются. Поэтому полное погружение нановолокон в клетки кардиомиоцитов, ответственных за передачу электромагнитных волн и, соответственно, за сокращения сердца, позволит тестировать электрическую проводимость клеток.
Данное исследование и дальнейшее понимание механизма взаимодействия сердечных клеток с подложкой позволят успешно создавать нановолокна для формирования необходимых свойств клеток и, соответственно, регенеративных (регенерирующих) тканей.
Работа поддержана грантом Министерства образования и науки Российской Федерации